OW Debug - Notice
Message: Trying to access array offset on value of type null
File: /home/romarekl/public_html/sosyallift.com/ow_plugins/forum/controllers/topic.php
Line: 136
Corona Virüsü ve FIP ( Feline Enfeksiyöz Peritonit Virüsünün Geneti...
Loading...
 
tr
Petshop Pazarı
Petshop Pazarı Mart 13 '18
Feline Enfeksiyöz Peritonit Virüsünün Genetiği ve Patogenezi

Feline coronavirus (FCoV), feral kedi popülasyonlarında ve kedi kolonilerinde endemiktir ve sıklıkla ölümcül feline enfeksiyöz peritonit (FIP) salgınlarından önce gelmektedir. FCoV, 2 biyotip sergiler: patojenik hastalık ve kedi enterik koronavirüs (FECV) ile iyi huylu bir enfeksiyon. Belirsizlik genetik olarak farklı avirülan ve öldürücü formları arada olup olmayacağı ile ilgili ya da in vivo olarak bir avirülan şekilde mutasyon olup kalır ,FIP neden oluyor. Bu alternatif hipotezleri çözmek için, FCoV ile enfekte olmuş klinik olarak sağlıklı ve hasta kedilerden (8 FIP vakası ve 48 FECV asemptomatik hayvan) viral sekansları izole ettik; 4 gen segmentinden 735 sekans üretildi ve filogenetik analizlere tabi tutuldu. Sağlıklı kedilerden viral sekanslar, membran ve yapısal olmayan protein 7b genlerinde gözlemlenen genetik mesafeler temelinde hasta kedilerden farklıydı . Bu veriler doğal popülasyonlarda belirgin dolaşımdaki virülan ve avirulent suşları göstermektedir. Ayrıca, FIP ile kedilerden fonksiyonel potansiyel farklılaşmış sağlıklı kedilerle 5 membran protein amino asit kalıntısı. Bu bulgular, virülan FIP ile ilişkili FCoV için tanısal belirteçler olarak potansiyele sahip olabilir.

Feline enfeksiyöz peritonit (FİP), kedigiller koronavirüs (FCoV) enfeksiyonunun neden olduğu nadir görülen, ölümcül, ilerleyici ve bağışıklığı arttırılmış bir hastalıktır. FCoV dünyada en yerli vahşi ve evcil olmayan kedi popülasyonları (seroprevalansı% 20-% 100) yaygın olmasına rağmen, FIP <FCoV seropozitif kedilerin (% 10 gelişecek ). FIP en sık kedilerde <2 yaş, daha az sıklıkla da geriatrik kedilerde ortaya çıkma eğilimindedir . FCoV enfeksiyonunun klinik belirtileri, bir patojenik hastalık, FIP (kedili enfeksiyöz peritonit virüsü [FIPV] ​​ile enfekte olmuş vakalar) ve daha yaygın olarak iyi huylu veya hafif enterik bir enfeksiyon (feline enterik koronavirüs [FECV] asemptomatik) olabilir. Bu klinik sonuçların spesifik genetik belirleyicileri henüz keşfedilmemiştir. FIFV'den avirulent FECV'yi ayırt edebilen etkili bir tedavi, aşı veya tanılama protokolü yoktur.

FIP patolojisi tipik olarak serozal membranların şiddetli sistemik inflamatuar hasarı ve akciğerlerde, karaciğerde, lenf dokusunda ve beyinde görülen yaygın piyogranülomatöz lezyonlarla karakterizedir . Kanıtlar, konakçı bağışıklık sisteminin bu patogenezde çok önemli olduğunu göstermektedir; periferik ve lenfatik dokulardan T-hücre deplesyonu ve sitokin ekspresyonundaki değişimler son evre FIP'de görülmektedir. Hipergammaglobulinemiyle ilişkili FİP'nin klinik bulgusu, virüsle indüklenen immün düzensizliğin göstergesidir .

Özellikle FIPV patojenezi ile ilişkili viral genetik determinantlar henüz keşfedilmemiştir. Bir in vivo mutasyon geçişi hipotezi de novo virüs mutasyonunun virülansa yol açarak in vivo olarak gerçekleştiğini ileri sürmüştür . Çalışmalar, spike proteini , yapısal olmayan protein (NSP) 7b ve NSP3c'nin hastalık belirleyicileri olarak sekans farklılıklarını önermesine rağmen, patogenezden sorumlu mutasyonun kesin doğası belirlenmemiştir. FIPV suşlarının tersine makrofajlar için FIPV suşlarının afinitesini açıklayan in vitro çalışmalarla birlikte , hipotez, enterik koronavirüsün (FECV) gastrointestinal sistemde bir mutasyonel kaymaya maruz kaldığı, böylece makrofajların, sistemik yayılımın ve ölümcül hastalık tezahürünün enfeksiyonuna izin verdiğinin önerilmesi için genişletildi . Bununla birlikte, operatif virülans belirleyicilerini tanımlamak için tasarlanan işlenmiş kimerik virüsleri kullanma girişimleri başarısız olmuştur . Ayrıca FCoV ile enfekte olmuş asemptomatik kedilerin farklı dokularında bulunan dolaşımdaki FCoV'ler ayırt edilemezdi .

FIPV patogenezinin in vivo mutasyon hipotezi, hiçbir zaman açıkça doğrulanmamış olmasına rağmen, geniş bir şekilde alıntılanmıştır. HIV-1'in mutasyonal geçişi, AIDS hastalarında gösterilmiştir, ki burada zarf kalıntıları, CD4 taşıyan lenfosit popülasyonunun çöküşüne bir başlangıç ​​olan CCR5'ten CXCR4'e kadar koreceptor kullanımını değiştirir . Benzer bir şekilde, domuz koronavirüs başak genindeki kilit amino asit değişiklikleri, koronavirüs hastalık oluşturma etkisi artan t , genç domuzlarda (hastalık ve ölüm oranlarının yüksek neden ransmissible gastroenterit virüsü ölümcül hastalığın ).

Viral patogenezin dolaşımda olan bir alternatif virülan-avirulent FCoV hipotezi, FECV'nin farklı benign ve patojenik suşlarının bir popülasyonda dolaştığını ve hastalığın yalnızca virülan suşların enfekte olduğu kişilerde gelişeceğini göstermektedir. Dang virüsü bir örnek sunabilir çünkü 4 farklı viral suşun dünya çapında dolaştığı ve farklı suşlara sırayla maruz kalan kişilerde ciddi hemorajik ateş geliştiği gösterilmiştir . Zoonotik atlar Venezüella ensefaliti virüsü, ekolojik ve epidemiyolojik faktörlerle etkileşerek, hastalık insidansına katkıda bulunan veya bunlarla kısıtlı olan dolaşan virülan ve avirulent suşları da gösterir .

Bu çalışma, in vivo mutasyon hipotezinin evrimsel tahminlerini, kedi içindeki FIP'in patojenisitesinde dolaşan virülent / avirulent hipotezine karşı sistematik olarak test etmeyi amaçlamıştır. FIP (vakalar) ve FECV-pozitif ancak asemptomatik kedilerin (kontroller) alan vakalarından örnekler toplayarak moleküler genetik araçları kullanarak doğal olarak oluşan FECV ve FIPV üzerine bir çalışma geliştirdik. Olgular kedigiller koronavirüs (FCoV) ile enfekte olmuş ve kedigiller enfeksiyöz peritonit (FIP) klinik hastalığı vardı. Kontroller ayrıca FCoV ile enfekte edildi, ancak klinik olarak asemptomatikti (FECV asemptomatik). Tahmin, viral gen sekanslarının filogenetik analizinin, in vivo mutasyon hipotezi desteklenirse FIP vaka kedileri ve FECV asemptomatik kediler için paraphili olduğunu göstermesi idi ). Ek olarak, FIP'de viral genetik çeşitlilik ve dinamikleri araştırdık ve patogenez ile ilişkili genetik imzaları belirledik.

In vivo mutasyon hipotezinin ikili dolaşan virülan / avirulent hipotezine karşı alternatif filogenetik öngörüler. A) In vivo mutasyon geçişi hipotezi, kedigillerdeki enfeksiyöz peritonit (FİP) vakalarının ve kedigillerinin paraphly olduğunu ...

Malzemeler ve yöntemler Örnekleme

2004-2006 döneminde Maryland veteriner hastanelerinde toplam 56 canlı, ötenazi veya yakın zamanda ölen evcil kedi klinik olarak muayene edildi ve örneklendi . Kan (3-6 mL), elle kısıtlanmış veya anestezi uygulanmış evcil kedilerden rutin olarak venipunktür ile toplandı. Dışkılar rektumdan pamuklu çubukla elde edildi ve 0.5 mL fosfat tamponlu salin içinde donduruldu. 6 çiftliğin 1 (Weller Farm) 'dan gelen kediler, tek tek kedilerin tekrar örneklemesi için mikro-çip (AVID, Folsom, LA, ABD) idi. Numuneler, İçişleri Bakanlığının ABD Balık ve Yaban Hayatı Servisi tarafından Ulusal Kanser Enstitüsü'ne verilen özel federal izinlere (Nesli Tükenmekte Olan Türler Uluslararası Sözleşmesi, Tehlike Altındaki ve Tehdit Altındaki Türler) tam olarak uygun şekilde toplanmıştır.

Ötanazi ve yakın zamanda ölen kediler için, 2 saatlik ölümler içinde, brüt otopsi muayenesi ve örnek toplama yapıldı. Karaciğer, dalak, mezenterik lenf nodu, böbrek, jejunum ve kolondan alınan numuneler alındı,% 10 tamponlu formalinde fikse edildi ve rutin olarak parafine gömüldü. Bölümler (5 mikron) hematoksilen ve eozin (HE) ile boyandı. Dokular ayrıca, RNA ekstraksiyonu için sıvı nitrojen (-220 ° C) içinde flaş dondurulmuş ve -220 ° C veya -70 ° C'de depolanmıştır.

Klinik Hematolojik ve Biyokimyasal Analiz

Tam kan sayımı için, taze (<12 saat) tam kan örnekleri, bir otomatik hücre sayacı (Avid Cell-Dyn 3500; Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, ABD) kullanılarak, Antech veteriner teşhis laboratuarı tarafından değerlendirildi. Biyokimyasal analiz (Hitachi 717 Klinik Kimya Analizörü; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, ABD) ve kedi bağışıklık yetersizliği virüsü için ELISA (FIV; Petchek FIV ELISA, Idexx Laboratories, Westbrook, ME, ABD) ve koronavirüs (Virachek CV, Synbiotics Corp. Ayrıca, San Diego, CA, ABD) antikorları da gerçekleştirilmiştir.

Patolojik ve İmmünhistokimyasal Analiz

HE-lekeli dalak, karaciğer, lenf nodu, bağırsak ve böbrek kesitleri, granülomatöz ve piyogranülomatöz lezyonların (Ulusal Kanser Enstitüsü Laboratuvar Hayvan Bilimleri Programı, Frederick, MD, ABD) kanıtları açısından değerlendirildi. Formalinle sabitlenmiş bölümler (3 mikron kalınlığında), parafin bloklarından kesildi ve daha önce açıklandığı gibi immünohistokimyasal (IHC) test için cam slaytlara yerleştirildi, klon koronavirüsünün (FECV ve FIPV biyoyakıtlarının gösterilmesi için çapraz reaksiyon gösteren bir antikor olan CoV p56) (Washington Hayvan Hastalığı Teşhis Laboratuvarı, Pullman, WA, ABD) .

A) Kornea koronavirüsüne karşı antikorlar için pozitif olan 23 nekropsili kedinin histopatolojik ve immünohistokimyasal (IHC) sonuçları. Karaciğer, akciğer, dalak, kolon, jejunum, mide, kalp, böbrek, lenf nodu IHC ile değerlendirildi. Feline bulaşıcı peritonit ...

RNA Ekstraksiyon ve Ters Transkripsiyon

160 μL asit sıvısından veya% 10 fosfat tamponlu salin içinde süspanse edilen dondurulmuş dışkıdan alınan RNA, üreticinin talimatlarına göre QIAamp virüsü RNA mini kiti (QIAGEN, Valencia, CA, ABD) kullanılarak ekstrakte edildi. Dokudaki RNA, üreticinin talimatlarına göre RNAeasy (QIAGEN) kullanılarak ≈60 mg donmuş karaciğer, akciğer, dalak, kolon, jejunum veya lenf düğümünden ekstrakte edildi. Ekstre edilen RNA, 35 μL RNaz içermeyen su içinde elüte edildi ve -70 ° C'de saklandı. cDNA, 50 ng rasgele heksamer ve 0.5 mmol / L dNTP ihtiva eden bir başlangıç ​​12-μL reaksiyon karışımı içinde 9 uL elüte RNA (10 ug-5 ug) kullanılarak ters transkribe edilmiştir. RNA'yı denatüre etmek için 65 ° C'de 5 dakika inkübasyondan sonra 10 mmol / L ditiyotreitol, 5 x Sentez Tamponu, 40 U RNaseOUT ve 15 ünite Thermoscript RT buz (Invitrogen, Carlsbad, CA, ABD) eklenmiştir. Reaksiyon karışımları 10 dakika 25 ° C'de termocycler içinde, ardından 30 dakika 50 ° C'de inkübe edildi. cDNA -20ºC'de saklandı.

PCR

7b (736 bp), membran proteini (575 bp), polimeraz (386 bp) ve başak-NSP3 (1.017 bp) amplifiye eden primerler , mevcut kedigiller koronavirüs dizisine dayanılarak tasarlandı . PCR, 50 mmol / L KCl, 10 mmol / L Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mmol / L MgC ihtiva eden bir 50-uL reaksiyonunda cDNA 2 uL kullanılarak gerçekleştirilmiştir 20.25 mmol / L dNTP (dATP, dCTP, dGTP ve dTTP) konsantrasyonları, her bir primerin 2 mmol / L konsantrasyonu ve 2.5 birim Platin Taq DNA polimerazı (Invitrogen). PCR, aşağıdaki konma koşulları ile bir genAmp PCR sistemi 9700 thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, ABD) üzerinde gerçekleştirildi: 94ºC'de 2 dakika sonra bir konma, her zaman 20 saniye 94ºC'de başlayıp 30 saniye sonra 60ºC'de (3) döngüleri), 58ºC (5 devir), 56ºC (5 devir), 54ºC (5 devir), 52ºC (22 devir) ve daha sonra uzatma için 72ºC'de 1 dakika ve 7 dakika boyunca 72ºC'de bir son uzatma ve bir tutuşla 4ºC. PCR ürünleri,% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde elektroforez ile görüntülendi ve primerler ve birleştirilmemiş dNTP'ler, Microcon YM (Millipore, Billerica, MA, ABD) kullanılarak çıkarıldı.

A) Elde edilen PCR ürünlerini (barlar) gösteren kedigil koronavirüs genomu. Yapısal proteinler koyu gri renkte gölgelenir; yapısal olmayan proteinler açık gri renkte gölgelenir. B) Virüs segmentlerini çoğaltmak için kullanılan ileri ve geri primerler 5 listed ...

Klonlama ve Sıralama

Temsili PCR ürünleri klonlandı ve dizildi . Klonlama, üreticinin talimatlarına göre bir TOPO-TA klonlama kiti (Invitrogen) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Plazmid DNA, her reaksiyon ürününden 1-47 klondan izole edildi (Agencourt CosMCPrep; Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA, ABD). Doğru boyutlu ekin varlığı kısıtlayıcı enzim sindirimi ( Eco RI) ile doğrulandı ve standart ABI BigDye sonlandırıcı reaksiyonları (Applied Biosystems) kullanılarak doğru insertli klonlardan sekanslar elde edildi. Anti-kontaminasyon önlemleri, ters transkripsiyon-PCR (RT-PCR) amplifikasyonu ve PCR sonrası işlemenin her adımında gerçekleştirilmiştir.

Filogenetik analiz

Elde edilen sekanslar, pol 1a, başak nsp3, zar ve NSP7b ayrı ayrı analiz edilmiştir. Nükleotid dizileri, ClustalX kullanılarak müteakip filogenetik analiz için derlenmiş ve hizalanmış ve görsel olarak doğrulanmıştır . Analizler, aşağıdaki yaklaşımlara dayanarak, viral gen dizilerinin filogenetik bir ağacının üretilmesini içermiştir: PAUP'da minimum evrim, maksimum parsimoni ve maksimum olabilirlik . En iyi dizi evrimi modelini tahmin etmek için model testi kullanıldı ve bu ayarlar sonraki analizlere dahil edildi ). En küçük evrim ağaçları Modeltest tarafından belirlenen ikame modellerinden inşa edilmiştir, komşuların birleştirilmesiyle elde edilen ağaçların başlangıcı, ardından en uygun ağacı bulmak için bir keşifsel araştırma sırasında bir ağaç-ikiye ayırma (TBR) dal değiştirme algoritmasının uygulanması. Maksimum parsimony analizi, adım adım ilaveler ve ardından TBR ile elde edilen, başlangıç ​​ağaçları ile ilgili bir sezgisel arama kullanmıştır. Modeltest tarafından belirlenen maksimum olabilirlik parametreleri, genel zaman-tersine çevrilebilir ikame modelini seçmiş, ampirik temel frekansları ve tahmini hız matrisini içermiş ve sahadaki oran değişimi (gama dağılımı) için düzeltilmiştir. Maksimum yineleme için en yakın komşu değişimi dal değişim algoritması kullanılarak maksimum parsimony ve minimum evrim ve 100 tekrar için 1000 yineleme kullanılarak bir bootstrap analizi yapıldı. ) ve ClustalX (www.softpedia.com/get/Science-CAD/Clustal-X.shtml ).

MEGA sürüm 3.0 'da değişken siteler ve şifreli bilgilendirici siteler hesaplanmıştır . Genetik mesafelerin çift yönlü karşılaştırmaları PAUP'de yapıldı ve genetik mesafelerin ortalaması ve aralığı Excel'de hesaplandı (Microsoft, Redmond, WA, ABD). FCoV pol 1a, membran, NSP 7b ve başak-NSP3 dizileri , katılımcılar tarafından GenBank'ta depolanmıştır.

Sonuçlar

2004–2006 döneminde, FIP'den şüphelenilen elli altı yerli kedi veya Maryland çiftliklerinden ve veteriner hastanelerinden enfekte FIP kedilerine maruziyet örneklendi. RT-PCR ürünleri üreten tüm numuneler, FCoV'ye karşı antikorlar için pozitif olan kedilerdendir (titreler> 25). Otuz altı örneklenmiş kedi, 3 yıllık çalışma dönemi boyunca yılda birkaç kez birkaç bireysel kedinin örneklendiği Weller çiftliğinden alındı. Sağlıklı ve yakın zamanda ölen veya ötenazi kediler Ambrose çiftliğinden (n = 7), Palmer Veteriner Hastanesi'nden (n = 3), Frederick County Hayvan Barınağından (n = 7), Seymour çiftliğinden (n = 1) ve Yeni Pazar'dan alındı. Hayvan Hastanesi (n = 2). Feca-4590, Weller çiftliğinden önemli bir FIP vakasıdır çünkü 20 Mayıs 2004 tarihinde, kedinin klinikte sağlıklı olduğu (predisease) ve yine 22 Aralık 2004'te FIP'nin kedi içinde geliştiği ve öldüğü zaman örnekler alınmıştır (postdisease). ).

Nipropsiler, şüpheli FIP nedeniyle ölen veya ötenazi yapılan 23 kedi üzerinde gerçekleştirildi. Nekropsi yapılan kedilerin çoğu FCoV antikoru pozitif idi . Sekiz kedinin histopatolojik bulgulara (Fca-4549, Fca-4566, Fca-4590, Fca-4618, Fca-4653, Fca-4662, Fca-4663 ve Fca-4664) dayanarak FIP vakaları olarak sınıflandırıldı Histoloji değerlendirmesinde piyogranülomatöz lezyonların varlığı bir FIP vakasının belirlenmesi için yeterliydi. Ek olarak, 8 FIP vakasının 5'i IHC testi ile değerlendirildi. Bu kedilerin her birinde IHC tarafından çoklu dokular pozitif idi. Bir kedi (Fca-4561) sadece jejunumda IHC pozitif ve tüm dokularda histopatolojik inceleme ile negatiftir, bu nedenle FECV asemptomatik olarak sınıflandırılmıştır. Karakteristik FIP histopatolojik değişiklikleri ve IHC lezyonu olmayan FCoV-seropozitif nekropsiye kediler FECV asemptomatik olarak sınıflandırıldı. Sağlıklı kediler fiziksel muayenelerde normal sonuçlara sahip olsaydı FECV asemptomatik olarak sınıflandırıldı, FCoV antikor pozitifti (titer> 25) ancak lenfopenik değil (<1.5 hücre / μL) veya 2007 yılına kadar izlendi ve FİP hastalığının olmadığı biliniyordu).

RT-PCR, tüm kediler için FCoV genlerinden tasarlanan 4 primer çifti ile denendi. 56 kediden alınan 82 örneklemden 42 örnekleme virüsü en az 1 primer çifti ile çoğaltmış ve viral sekansın% 51'lik bir iyileşme oranını sağlamıştır . Klinik FIP ve 23 FECV asemptomatik kedisi olan 8 kediden, 4 viral bölgeden gelen amplifikasyon, 501 benzersiz gen sekansı ile sonuçlanan 735 klonlanmış viral gen segmentleri üretti.

2004-2006 döneminde örneklenen 3 Maryland lokali klonlanmış virüs sekanslarının filogenetik analizi, spesifik viral dinamik paternleri gösterdi. Birincisi, FECV ile enfekte olmuş sağlıklı kedilerin gen dizileri, membran , NSP 7b ve başak-NSP3 gen segmentlerinde FIP teşhisi konulan kedilerden genellikle farklı olan monofilik bir küme deseni sergilemiştir . Örneğin, FIP vakalarından membran genine yönelik her bir FCoV gen dizisi, 3 ana kanadı içeren büyük bir küme içine düşmüştür. Buna karşılık, FECV asemptomatik kedilerinden 127/154 (% 82) virüs gen sekansı, FIP vakalarının viral gen sekanslarından ayrı (100 bootstrap istatistiksel destek) olmak üzere 2 ayrı klavyede sıralanmıştır. FECV-asemptomatik kedilere karşı FIP vakaları için 140 NSP7b sekansının benzer tek yönlü monofili elde edildi. Ayrıca , bu bölgedeki gen ayrışması üzerindeki evrimsel kısıtlamalar nedeniyle daha az istatistiksel çözümle de olsa , sivri-NSP3 genlerini kapsayan 1.017-bp dizisi için tutarlı bir hastalık güdümlü filogenetik sıralama gözlemlenmiştir . Bu 3 gende dikkat çekici karşılıklı monofillik birlikte Şekil de resmedilen dolaşımdaki virülan-avirulent suş hipotezinin tahminlerini desteklemektedir .

Monofilik hastalık durumu ile korelasyon gösteren 3 feline koronavirüs (FCoV) genler membran, yapısal olmayan protein 7b ( NSP 7b ) ve başak-NPS3 gen dizileri benzersiz dizileri Maksimum olabilirlik (ML) filogenetik ağacı . Klonlanmış diziler ...

1 kedi, Fca-4590'dan örnekler özellikle bilgilendiriciydi. Virüs, kedi yatkınlığından izole edildi ve daha sonra 7 ay sonra, postdisease edildi. Fca-4590 asemptomatikti, ancak Mayıs 2004'te FECV ile enfekte edildi. Bu aydan itibaren FCoV örneklemesi, membran ve NSP7b genleri için FECV asemptomatik klavuzlarıyla güçlü (yüksek önyükleme) bağlanma gösterdi . Ancak, FAC-4590'da FIP-4590'da geliştirilen FIP-sonrası klavuzları (yüksek bootstrap ile) düştükten ve FIP ile diğer kedilerden izole edilen FCoV'den ayırt edilemediğinden, Aralık 2004'te 7 ay sonra virüs izole edilmiştir. Bu bulgu, FCoV'nin patojenik FIP vaka tipinin, bu kediyi bir avirulent FECV ile enfekte edildikten sonra enfekte ettiğini ve görünüşe göre yerini aldığını gösterdi.

Her kedi içinde dokuya özgü farklılaşma minimaldi . Aksine, hasta ve sağlıklı kedilerde yerele özgü belirgin farklılıklar vardı . Örneğin, Weller ev halkından gelen asemptomatik kedilerdeki FECV suşları, büyük bir FECV subklatında bir araya getirilmiştir; Frederick Hayvan Barınağı'ndan elde edilen kedilerdeki suşlar, FECV asemptomatik klavyenin içine yerleştirilmiş farklı bir alt küme içinde sınıflandırılmıştır. 1982'de Oregon'daki çitalardan izole edilen arşivsel FCoV virülent suşu (Aju-92), Maryland iç kedilerinde çözülen FIP ve FECV asemptomatik klamplardan farklı bir filogenetik soyu tanımlamıştır .

Bu çalışmada üretilen nükleotid membran ve NSP 7b dizileri amino asit dizilerine çevrilmiştir . Patogenez ile ilgili olarak, potansiyel olarak 6 kompozit genotipe yol açan, 108, 120, 138, 163 ve 199 pozisyonlarında (TGEV GenBank no. NP058427 için referans dizisine dayanarak) membran proteininde 5 bilgilendirici amino asit sahası bulundu . FECV-asemptomatik kedilere karşı FIP vakalarının tanısı . FIP'li 8 kedi, 19 FECV asemptomatik kedisi ve FIP'li 1 çita, bu 5 tanısal alana göre 6 kompozit genotip tespit edilmiştir.

FIP ile patolojik veya immünohistokimyasal değişiklikler ile teşhis edilen tüm evcil kediler ya YIVAL (I) ya da YIIAL (II) 'nin amino asit imzasını gösterdi; Klinik FIP olmaksızın enfekte kediler HIIVI (III), HIIVL (IV), HVIAL (V), YVVAL (VI) veya YIVAL (I) haplotipe sahipti. Hiçbir FIP vakasında haplotip III, IV, V veya VI, 3 FECV asemptomatik kedinin ise FIP vakalarında baskın olarak bulunan YIVAL imzasını taşıması . Bunlardan 2 kedinin (4624 ve 4657) örnekleme zamanında ötenazi yapıldı (tüm ötenazi FECV-asemptomatik kediler Ek Tablo 'da açık yeşil renkte vurgulanmıştır)); Bu nedenle, bu kedilerde klinik FIP'nin daha sonra geliştirilip geliştirilemeyeceği bilinmemektedir. Diğer istisna, kedi 4594, iki kez (2004 yılında ve 2006 yılında) örneklenmiş; 2004 yılında YIVAL'den 2006 yılında HIIVI'ya genetik imzadaki anahtar, bu kedinin 2004 örneklemesinden sonra virülan bir FIPV soyunu temizleyebildiğini ve 2006 yılına kadar bir avirulent suş ile yeniden enfekte edildiğini gösterebilir. FECV'den FIP vakalarını farklılaştıran güçlü bir filogenetik sinyal olmasına rağmen NSP 7b'de asemptomatik kediler görüldü , NSP 7b nükleotidinde veya amino asit dizilimlerinde FECV asemptomatik kontrollere karşılık FIP vakalarına özgü hiçbir tanısal amino asit değişikliği görülmedi . Membrandaki monofiletik bulguların aksine , NSP 7b veBaşak - NSP3 genleri, pol 1a'nınklonlanmış viral sekansları , hastalık fenotipi açısından parafizikti .

Tartışma

Çoğu kedilerde virüs klinik belirtilere yol açmasa da, FCoV ile enfekte tüm dünyada kedilerde yaygındır. Bununla birlikte, bazı kedilerde, FCoV enfeksiyonu FIP'in ilerleyici ve ölümcül hastalık tezahürünün gelişimi ile ilişkilidir. Bu hastalık, sadece ölümcül yapısı nedeniyle değil, aynı zamanda FIP antemorteminin teşhisinde ve FCoV'un yayılmasının kontrol edilmesindeki zorluklar nedeniyle, kedilerde en ciddi viral enfeksiyonlar arasındadır. Doğal olarak oluşan FCoV enfeksiyonu ve membran, NSP 7b, spike-NSP3 ve pol 1a'dan elde edilen klonlanmış virüs sekanslarının filogenetik analizi için moleküler virolojik bir çalışma sunduk.2004–2006 yılları arasında FCoV ile enfekte edilmiş Maryland hanelerinde bulunan evcil kedilerden izole edilen genler. İn vivo mutasyon hipotezini sorgulayan FIP patogenezinin dolaşımdaki virülent / avirulent hipotezi ile tutarlı membran ve NSP 7b genlerindeki hastalık fenotipiyle korelasyon gösteren suşların ağırlıklı olarak monofilize kümelenmesini gözlemledik .

Ek Şekil 'de sunulan amino asit hizalamalarıBu çalışmada yer alan FIPV vakalarında, hastalık fenotipi ile ilişkili genotiplerin, ancestrally türetilmiş olduğunu ve birkaç de novo mutasyonunun sonucu olmadığını açıkça göstermektedir. FIP vakaları ve çoklu gen segmentlerinde FECV asemptomatik kediler arasındaki virüsler arasındaki net genetik farklılaşma göz önüne alındığında, kedilerin in vivo mutasyonlar yerine, dış kaynaklardan yeni FCoV suşları ile yeniden enfekte olduklarını çıkardık. Çalışmamızdaki kediler aynı zamanda çok sayıda FECV ve FIPV suşu ile birlikte enfekte edilmemiş ve genellikle bir baskın virüs suşu ile enfekte edilmiştir. Çalışmamızdaki bu iki istisna, farklı gastrointestinal (dışkı veya bağırsak) ve sistemik (karaciğer ve / veya asit sıvısı) viral izolatların elde edildiği FIPV (Fca-4662 ve 4664) vakaları olan kedilerdi.

FIP patogenezinde zar proteininin rolü, diğer koronavirüslerde bilinen işlevleri göz önüne alındığında olası gibi görünmektedir. Membran proteini, virüs tomurcuklanmasında ve hücre aracılı konakçı bağışıklığında önemli işlevlere sahip en bol yapısal proteindir . Membran proteini amino asit sekanslarının spesifik fonksiyonları, şiddetli akut respiratuar sendrom (SARS) –CoV 'de belirlenmiştir. Bu çalışmadan sekansların SARS-CoV ile hizalanması, ilk tanısal amino asit sahası (108), ikinci transmembran sarmalından hemen yukarısına bir alana hizalanır . Tüm FIPV biyotiplerinde bulunan ve SARS-CoV arasında paylaşılan 108 pozisyonundaki bir tirozin nötral bir polariteye sahiptir (buradaki bir histidinin aksine, pozitif bir polariteye sahip olan çoğu FECV biotipinde bulunur) ve Virüsün zar içindeki kararlılığı. Saha 120, üçüncü transmembran sarmalın içinde hizalanır, şantiye 138, transmembran helezinin aşağı akışına hizalanır, 163 noktası, C-terminusu içinde, virüs partikülünün içerisine yerleştirilir ve C-terminus alanı içinde de 199 bölgesi, tanımlanmış SARS-immünodominant epitop .

3 transmembran heliks, bir dış N terminali ve bir iç karboksi terminali içeren zar proteininin diyagramı. Şiddetli akut sekansın sekans karşılaştırması ile belirlenen 5 değişken diyagnostik amino asit bölgesinin yaklaşık konumu (bkz. Tablo 2) .

Membran proteini amino asit dizilişindeki 5 değişken bölgeye dayanan 6 doğal olarak oluşan kompozit genotipin, hastalık fenotipi ile yüksek derecede ilişkili olduğu gösterilmesi teşhis geliştirmek ve bu hastalığın önleyici yönetimi için özel fırsatlar sunmaktadır. Bu çalışmayı farklı coğrafi bölgelerdeki ek kedi popülasyonlarına genişletmek, kimerik FCoV zorlama deneyleri tasarlamak ve patogenez ile konakçı genetik korelasyonları araştırmak suretiyle FIP patogenezinde nedensel faktörleri daha fazla ayırt edebilmekteyiz. FIP'ye boyun eğmeden hastalık ile ilişkili genotip kompozit ile enfekte olan Fca-4594, viral patogenez için ek şartlar önerir. Esir çitalarının kolonisinde FIP salgında öne sürüldüğü gibi , konakçı immün genetik bir rol oynayabilir.

Hem viral suş hem de konak immün genleri, HIV enfeksiyonunda AIDS ilerlemesi gibi, hastalığın ilerlemesine ve virüse bağlı ölümlere katkıda bulunur. Burada tarif edilen tam kedi genom dizisi ve viral genotip kompozitlerin yakın zamanda yayınlanmasıyla birlikte , yeni genomik araçlar, hem viral hem de konakçı genetik ilişkilendirme çalışmalarının FCoV enfeksiyonundaki patojenezde ilerlemesi için hazırdır. SARS-CoV gibi insanlar.

Paylaş: